L'applicazione di RT-PCR in tempo reale a Covid-19

Che cos'è RT-PCR in tempo reale?

L'aggiunta di geni fluorescenti al sistema di reazione della PCR, l'utilizzo dell'accumulo del segnale di fluorescenza per monitorare l'intero processo di PCR in tempo reale, e quindi la quantificazione del modello sconosciuto attraverso una curva standard è chiamata tecnologia PCR quantitativa di fluorescenza in tempo reale, nota anche come Q in tempo reale -PCR.

Il principio dell'amplificazione della PCR è lo stesso di quello del normale strumento PCR, tranne per il fatto che i primer aggiunti durante l'amplificazione della PCR sono etichettati con isotopi, fluoresceina, ecc. E che i primer e le sonde fluorescenti sono usati per legarsi specificamente al modello per l'amplificazione a lo stesso tempo.

I risultati amplificati vengono raccolti e trasmessi al sistema di analisi ed elaborazione del computer attraverso il segnale di raccolta in tempo reale del sistema di raccolta del segnale di fluorescenza per ottenere un risultato quantitativo in tempo reale.

RT-PCR in tempo reale è uno dei metodi di laboratorio più utilizzati per rilevare il virus COVID-19. Mentre molti paesi hanno utilizzato RT-PCR in tempo reale per diagnosticare altre malattie, come il virus Ebola e il virus Zika, molti hanno bisogno di supporto per adattare questo metodo per il virus COVID-19, nonché per aumentare le proprie capacità di test nazionali.

Come funziona la RT-PCR in tempo reale con il virus COVID-19?

Un campione viene raccolto dalle parti del corpo in cui si riunisce il virus COVID-19, come il naso o la gola di una persona. Il campione viene trattato con diverse soluzioni chimiche che rimuovono sostanze come proteine ​​e grassi e che estraggono solo l'RNA presente nel campione. Questo RNA estratto è un mix del materiale genetico della persona e, se presente, dell'RNA del virus.

L'RNA è trascritto inverso nel DNA usando un enzima specifico. Gli scienziati aggiungono quindi ulteriori brevi frammenti di DNA complementari a parti specifiche del DNA virale trascritto. Se il virus è presente in un campione, questi frammenti si attaccano alle sezioni bersaglio del DNA virale. Alcuni dei frammenti genetici aggiunti vengono utilizzati per costruire filamenti di DNA durante l'amplificazione, mentre altri vengono utilizzati per costruire il DNA e aggiungere etichette marcatore ai filamenti, che vengono quindi utilizzati per rilevare il virus.

La miscela viene quindi inserita in una macchina RT – PCR. La macchina scorre ciclicamente le temperature che riscaldano e raffreddano la miscela per innescare reazioni chimiche specifiche che creano nuove copie identiche delle sezioni bersaglio del DNA virale. Il ciclo viene ripetuto più volte per continuare a copiare le sezioni target del DNA virale. Ogni ciclo raddoppia il numero precedente: due copie diventano quattro, quattro copie diventano otto e così via. Una configurazione RT-PCR standard in tempo reale di solito passa attraverso 35 cicli, il che significa che, alla fine del processo, vengono creati circa 35 miliardi di nuove copie delle sezioni di DNA virale da ogni filamento del virus presente nel campione .

Man mano che vengono create nuove copie delle sezioni del DNA virale, le etichette dei marker si attaccano ai filamenti di DNA e quindi rilasciano un colorante fluorescente, che viene misurato dal computer della macchina e presentato in tempo reale sullo schermo. Il computer tiene traccia della quantità di fluorescenza nel campione dopo ogni ciclo. Quando viene superato un certo livello di fluorescenza, ciò conferma la presenza del virus. Gli scienziati monitorano anche quanti cicli sono necessari per raggiungere questo livello al fine di stimare la gravità dell'infezione: minore è il numero di cicli, più grave è l'infezione virale.

Perché usare RT-PCR in tempo reale?

La tecnica RT – PCR in tempo reale è altamente sensibile e specifica e può fornire una diagnosi affidabile in appena tre ore, anche se i laboratori impiegano in media tra le sei e le otto ore. Rispetto ad altri metodi di isolamento dei virus disponibili, RT-PCR in tempo reale è significativamente più veloce e ha un potenziale inferiore di contaminazione o errori, poiché l'intero processo può essere eseguito all'interno di un tubo chiuso. Continua ad essere il metodo più accurato disponibile per il rilevamento del virus COVID-19.

Tuttavia, la RT-PCR in tempo reale non può essere utilizzata per rilevare le infezioni passate, il che è importante per comprendere lo sviluppo e la diffusione del virus, poiché i virus sono presenti nel corpo solo per un periodo di tempo specifico. Altri metodi sono necessari per rilevare, tracciare e studiare le infezioni passate, in particolare quelle che possono essersi sviluppate e diffuse senza sintomi.